1.范围
本标准规定了食品中β型溶血性链球菌( Streptococcus)的检验方法。
本标准适用于食品中β型溶血性链球菌的检验。
2.术语和定义
2.1 B型溶血
在菌落周围形成完全透明的溶血环,红细胞完全溶解。
2.2 β型溶血性链球菌
能够产生β型溶血的化脓(或A群)链球菌( Streptococcus pν genes)和无乳(或B群)链球(Streptococcus agalactiae）。
3.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 恒温培养箱:36℃C±1℃；
b) 冰箱:2℃～5℃;
c) 厌氧培养装置;
d) 天平:感量0.1g；
e) 均质器与配套均质袋；
f) 显微镜:10倍～100倍;
g) 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.lmL刻度)或微量移液器及吸头;
h) 无菌锥形瓶:容量100mL、200mL、2000mL；
i) 无菌培养皿:直径90mm；
j) pH计或pH比色管或精密pH试纸;
k) 水浴装置:36℃±1℃；
l) 微生物生化鉴定系统。
4.培养基和试剂
4.1 改良胰蛋白胨大豆肉汤( Modified tryptone soybean broth,mTSB):见附录A中A.1。
4.2 哥伦比亚CNA血琼脂( Columbia cna blood agar):见附录A中A.2。
4.3 哥伦比亚血琼脂( Columbia blood agar):见附录A中A3。
4.4 革兰氏染色液:见附录A中A4。
4.5 胰蛋白胨大豆肉汤( Tryptone soybean broth,TSB):见附录A中A.5。
4.6 草酸钾血浆:见附录A中A.6。
4.7 0.25%氯化钙(CaCl2)溶液:见附录A中A.7。
4.8 3%过氧化氢H2O2)溶液:见附录A中A8。
4.9 生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡。
5.检验程序
溶血性链球菌检验程序见图1。
6.操作步骤
6.1 样品处理及增菌
按无菌操作称取检样25g(mL),加入盛有225mL mTSB的均质袋中,用拍击式均质器均质1min～2min;或加入盛有225mL mTSB的均质杯中,以8000r/min～10000r/min均质1min～2min。若样品为液态,振荡均匀即可。36℃±1℃培养l8h～24h。
6.2 分离
将增菌液划线接种于哥伦比亚CNA血琼脂平板,36℃±1℃厌氧培养18h～24h,观察菌落形态。溶血性链球菌在哥伦比亚CNA血琼脂平板上的典型菌落形态为直径约2mm～3mm,灰白色、半透明、光滑、表面突起、圆形、边缘整齐,并产生β型溶血。
6.3 鉴定
6.3.1 分纯培养
挑取5个(如小于5个则全选)可疑菌落分别接种哥伦比亚血琼脂平板和TSB增菌液,36℃±1℃培养18h～24h。
6.3.2 革兰氏染色镜检
挑取可疑菌落染色镜检。β型溶血性链球菌为革兰氏染色阳性,球形或卵圆形,常排列成短链状。
6.3.3 触酶试验
挑取可疑菌落于洁净的载玻片上,滴加适量3%过氧化氢溶液,立即产生气泡者为阳性。β型溶血性链球菌触酶为阴性。
6.3.4 链激酶试验(选做项目)
吸取草酸钾血浆0.2mL于0.8mL灭菌生理盐水中混匀,再加入经36℃±1℃培养l8h～24h的可疑菌的TSB培养液0.5mL及0.25%氯化钙溶液0.25mL,振荡摇匀,置于36℃±1℃水浴中10min,血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置,内容物不流动)。继续36℃±1℃培养24h,凝固块重新完全溶解为阳性,不溶解为阴性,β型溶血性链球菌为阳性。
6.3.5 其他检验
使用生化鉴定试剂盒或生化鉴定卡对可疑菌落进行鉴定。
7.结果与报告
综合以上试验结果,报告每25g(mL)检样中检出或未检出溶血性链球菌。
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