1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中维生素B12的测定。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
利用莱士曼氏乳酸杆菌( Lactobacillus leichmannii)对维生素B12的特异性和灵敏性,定量测定出试样中维生素B12的含量。在测定用培养基中供给除维生素B1以外的所有营养成分,这样微生物生长产生的透光率就会同标准曲线工作液及未知待测溶液中维生素B12的含量相对应。以不同浓度标准溶液的透光率相对于各浓度水平标准物质的浓度绘制标准曲线,根据标准曲线即可计算出试样中维生素B12的含量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1 菌株:莱士曼氏乳酸杆菌( Lactobacillus leichmannii)ATCC 7830。
4.2 维生素B12( Vitamin B12或 Cyanocobalamin)标准品:分子式C63H88CON14O14P,纯度≥99%。
4.3 培养基
4.3.1 乳酸杆菌琼脂培养基:见附录A。
4.3.2 乳酸杆菌肉汤培养基:见附录A。
4.3.3 维生素B12测定用培养基:见附录A。
注:一些商品化合成培养基效果良好,商品化合成培养基按标签说明进行配制。
4.4 9g/L氯化钠溶液(生理盐水)
称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水中,分装于具塞试管,每管10mL。121℃灭菌15min。
4.5 乙醇溶液:体积分数为25%。
4.6 无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
4.7 无水偏重亚硫酸钠(Na2S2O5)。
4.8 柠檬酸(含一个结晶水)(C6H8O7·H2O)。
4.9 标准溶液的制备
4.9.1 维生素B12贮备液(10μg/mL):精确称取维生素B12标准品(4.2),用乙醇溶液(4.5)定容至维生素B12浓度为10μg/mL。
4.9.2 维生素B12中间液(100ng/mL):用乙醇溶液(4.5)将5.0mL维生素B12贮备液(4.9.1)定容至500mL。
4.9.3 维生素B12工作液(1ng/mL):用乙醇溶液(4.5)将5.0mL维生素B12中间液(4.9.2)定容至500mL
4.9.4 标准曲线工作液:分别吸取两个5mL维生素B12工作液(4.9.3)于250mL和500mL容量瓶中,用水定容至刻度。高浓度溶液的浓度为0.02ng/mL;低浓度溶液的浓度为0.01ng/mL。
注:所有标准溶液要储存于冰箱内。4.9.1、4.9.2和4.9.3保存期三个月,4.9.4临用前配制。
5.仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
5.1 天平:感量为0.1mg。
5.2 pH计:精度≤0.01。
5.3 分光光度计。
5.4 涡旋混合器。
5.5 离心机:转速≥2000转/分钟。
5.6 恒温培养箱:36℃±1℃。
5.7 冰箱:2℃～5℃。
5.8 无菌吸管:10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器和吸头。
5.9 瓶口分液器:0mL～10mL。
5.10 锥形瓶:200mL。
5.11 容量瓶(A类):100mL,250mL,500mL。
5.12 单刻度移液管(A类):容量5mL。
5.13 漏斗:直径90mm。
5.14 定量滤纸:直径90mm。
5.15 试管:18mm×180mm。
注:准备玻璃仪器时,使用活性剂对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗,清洗之后要求在200℃干热2h。
6.分析步骤
6.1 测试菌液的制备
6.1.1 将莱士曼氏乳酸杄菌(ATCC 7830)的冻干菌株(4.1)活化后,接种到乳酸杆菌琼脂培养基(4.3.1)上,36℃±1℃培养24h。再转种2代～3代来增强活力。置2℃～5℃冰箱保存备用。每15d转种一次。
6.1.2 将活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基(43.2)中,36℃±1℃培养18h～24h,以2000转/分钟离心2min～3min,弃去上清液,加入10mL生理盐水(4.4),混匀,再离心2min～3min,弃去上清液,再加入10mL生理盐水(4.4),混匀。如前离心操作,弃去上清液。再加10mL生理盐水(4.4),混匀。吸适量该菌悬液于10nL生理盐水(4.4)中,混匀制成测试菌液。
6.1.3 用分光光度计(5.3),以生理盐水(4.4)做空白,于550nm波长下测测试菌液(6.1.2)的透光率,使其透光率在60%～80%之间。
6.2 试样的处理
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