1.范围
本标准规定了婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定方法。
本标准适用于婴幼儿食品和乳品中游离生物素的测定规范性引用文件。
2.规范性引用文件
本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本标准。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本标准。
3.原理
利用植物乳杆菌(Lactobacillus plantarun)对游离生物素的特异性和灵敏性,定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基中,微生物的生长与待测物质含量呈线性关系,根据透光率与标准工作曲线进行比较,即可计算出试样中待测物质的含量。
4.试剂和材料
除非另有规定,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。
4.1 菌株:植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum),ATCC 8014。
4.2 生物素(d-Biotin或Vitamin H)标准品(C10H16N2O3S):纯度≥99%。
4.3 培养基
4.3.1 乳酸杆菌琼脂培养基:见附录A。
4.3.2 乳酸杆菌肉汤培养基:见附录A。
4.3.3 生物素测定用培养基:见附录A。
注:一些商品化合成培养基效果良好,商品化合成培养基按标签说明进行配制。
4.4 乙醇溶液(50%)。
4.5 硫酸溶液(3%):量取3mL硫酸加入到水中,定容至100mL。
4.6 氢氧化钠溶液(0.5mol/L):称取20g氢氧化钠溶于1000mL水中。
4.7 氯化钠溶液(9g/L):称取9.0g氯化钠溶解于1000mL水中,分装试管,每管10mL。121℃灭菌15min。
4.8 标准溶液的制备
4.8.1 生物素标准贮备液(100μg/mL):称取生物素标准品(4.2)用乙醇溶液(4.4)定容至生物素浓度为100μg/mL,贮于冰箱中。
4.8.2 生物素标准中间液(lμg/mL):吸取1mL生物素标准贮备液(4.8.1),用乙醇溶液(44)定容至100mL。
4.8.3 生物素标准工作液(10ng/mL):吸取1mL生物素标准中间液(4.8.2),用乙醇溶液(4.4)定容至100mL。
4.8.4 标准曲线工作液
分两个浓度,高浓度溶液的浓度为0.2ng/mL;低浓度溶液的浓度为0.lng/mL。从工作液中(4.8.3)吸取两次各5mL,用水分别定容到250mL和500mL。
注:所有标准溶液要储存于冰箱内。4.8.1、4.8.2、和4.8.3保存期三个月,4.8.4临用前配制。
5.仪器和设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
5.1 天平:感量为0.1mg。
5.2 pH计:精度≤0.02。
5.3 分光光度计。
5.4 涡旋混合器。
5.5 离心机:转速≥2000转/分钟。
5.6 恒温培养箱:36℃±1℃。
5.7 冰箱:2℃～5℃。
5.8 无菌吸管:10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器或吸头。
5.9 瓶口分液器:0mL～10mL。
5.10 锥形瓶:200mL。
5.11 容量瓶(A类):100mL,250mL,500mL。
5.12 单刻度移液管(A类):容量5mL。
5.13 漏斗:直径90mm。
5.14 定量滤纸:直径90mm。
5.15 试管:18mm×180mm。
注:玻璃仪器使用前,用活性剂〔月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可)对硬玻璃测定管及其他必要的玻璃器皿进行清洗,清洗之后在200℃干热2h。
6.分析步骤
6.1 接种菌悬液的制备
6.1.1 将冻干菌株(4.1)活化后,转接到乳酸杆菌琼脂培养基(4.3.1)中,36℃±1℃培养过夜。再转接2～3代来增强活力。然后再将其从固体培养上转接到乳酸杄菌肉汤培养基(4.3.2)中培养。
6.1.2 将乳酸杆菌肉汤中的培养液以2000转/分钟离心2min～3min,倾出上清液,加入10mL氯化钠溶液(4.7),混匀,再离心2min～3min,如此清洗3次～4次,吸适量该菌悬液于10mL盐水(4.7)中,待测。
6.1.3 用分光光度计以氯化钠溶液(4.7)做空白,于550nm波长下测菌悬液(6.1.2)的透光率,使其透光率在60%～80%之间。
6.2 样品的处理
6.2.1 干粉样品
称取一定量样品(精确至0.0001g)于250mL三角瓶中,该样品应含0.2μg～0.5μg生物素。继续6.2.3步骤。
6.2.2 液体样品
吸一定量的液体样品于250mL三角瓶中,该样品应含0.2μg～0.5μg生物素。继续6.2.3步骤。
6.2.3样品的提取
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