1.范围
本标准规定了蜂胶中芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、髙良姜素含量的液相色谱串联质谱和液相色谱测定方法。
本标准适用于蜂胶中芦了、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因、高良姜素含量的测定。
本标准液相色谱-串联质谱法的检出限:芦丁为0.15g/kg;杨酶酮为0.050g/kg;槲皮素、髙良姜素为0.025g/kg;莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因为0.0060g/kg。液相色谱法的检出限:杨梅酮、莰菲醇芹菜素、苛因为0.10g/kg;芦丁、槲皮素、松属素、高良姜素为0.20g/kg。
2.规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。
GB/T 6379 测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法的重现性和再现性(GB/T 6379-1986,neq ISO 5725:1981)
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法(GB/T 6682-1992,neq ISO 3696:1987)
3.原理
甲醇溶解试样,反相液相色谱柱分离黄酮化合物,八种黄酮化合物用液相色谱-串联质谱仪测定或用高效液相色谱紫外检测器测定,外标法定量。
4.试剂和材料
除另有说明外,所用试剂均为优级纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 甲醇:色谱纯。
4.2 磷酸。
4.3 甲醇+水(1+1):量取50mL甲醇与50mL水混合。
4.4 芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准物质:纯度≥99%。
4.5 芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和高良姜素标准储备溶液:准确称取适量的每种标准物质(4.4),用甲醇(4.1)配制成浓度为0.10mg/mL的混合标准储备溶液。
4.6 芦丁、杨梅酮、槲皮素、莰菲醇、芹菜素、松属素、苛因和髙良姜素标准工作溶液:根据需要用甲醇(4.1)和甲醇十水(4.3)将标准储备溶液(4.5)分别稀释成适当浓度的标准工作溶液。
5.仪器
5.1 液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源。
5.2 高效液相色谱仪:配有紫外检测器。
5.3 温度可调超声波水浴。
5.4 注射过滤器:容积为3mL或5mL,并带有0.45μm过滤膜。
5.5 微量注射器:25μL。
6.分析步骤
6.1 试样溶液的制备
称取0.1g～0.2g试样,精确到0.001g,置于50mL容量瓶内,加入40mL甲醇,在60℃的超声波水浴中,振荡40min,待样品完全溶解后,取出冷却至室温。然后用甲醇定容至50mL～100mL,摇匀。用注射过滤器将试样溶液过滤至样品瓶内,摇匀后,供液相色谱仪测定。过滤的样液取1mL与1mL水混合后,供液相色谱串联质谱仪测定。
6.2 测定
6.2.1 液相色谱条件
6.2.1.1 串联质谱法
a) 色谱柱: Mightysil RP-18 3μm 150mm×4.6mm(内径)或相当者;
b) 流动相:甲醇+水(65+35),用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;
c) 流速:0.3mL/min;
d) 进样量:20μL。
6.2.1.2 紫外检测法
a) 色谱柱: Mightysil RP-18 3μm 150mm×4.6mm(内径)或相当者;
b) 流动相:甲醇+水(58+42),用磷酸(4.2)调节流动相至pH=3;
c) 流速:0.7mL/min;
d) 检测波长:270nm;
e) 进样量:10μL。
6.2.2 质谱条件
a) 扫描方式:正离子扫描;
b) 检测方式:多反应检测;
c) 电喷雾电压:4000V;
d) 雾化气压力:0.055MPa;
e) 气帘气压力:0.069MPa;
f) 辅助气流速:6L/min;
g) 离子源温度:380℃;
h) 去簇电压:100V;
i) 定性离子对、定量离子对和碰撞气能量,见表1。
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