1.范围
本标准规定了食品中肉毒梭菌( Clostridium botulinum)及肉毒毒素( botulinum toxin)的检验方法。
本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验。
2.设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下：
2.1 冰箱:2℃～5℃、-20℃。
2.2 天平:感量0.1g。
2.3 无菌手术剪、镊子、试剂勺。
2.4 均质器或无菌乳钵。
2.5 离心机:3000r/min、14000r/min。
2.6 厌氧培养装置。
2.7 恒温培养箱:35℃±1℃、28℃±1℃。
2.8 恒温水浴箱:37℃±1℃、60℃±1℃、80℃±1℃。
2.9 显微镜:10倍～100倍。
2.10 PCR仪。
2.11 电泳仪或毛细管电泳仪。
2.12 凝胶成像系统或紫外检测仪。
2.13 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。
2.14 可调微量移液器:0.2μL～2μL、2μL～20μL、20μL～200μL、100μL～1000μL。
2.15 无菌吸管:1.0mL、10.0mL、25.0mL。
2.16 无菌锥形瓶:100mL。
2.17 培养皿:直径90mm。
2.18 离心管:50mL、1.5mL。
2.19 PCR反应管。
2.20 无菌注射器:1.0mL。
2.21 小鼠:15g～20g,每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠。
3.培养基和试剂
除另有规定外,PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准,水应符合GB/T 6682中一级水的要求。
3.1 庖肉培养基:见A.1。
3.2 胰蛋白酶胰蛋白胨葡萄糖酵母膏肉汤( TPGYT):见A.2。
3.3 卵黄琼脂培养基:见A.3。
3.4 明胶磷酸盐缓冲液:见A.4。
3.5 革兰氏染色液:见A.5。
3.6 10%胰蛋白酶溶液:见A.6。
3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见A.7。
3.8 1mol/L氢氧化钠溶液。
3.9 1mol/L盐酸溶液。
3.10 肉毒毒素诊断血清。
3.11 无水乙醇和95%乙醇。
3.12 10mg/mL溶菌酶溶液。
3.13 10mg/mL蛋白酶K溶液。
3.14 3mol/L乙酸钠溶液(pH5.2)。
3.15 TE缓冲液
3.16 引物:根据表1中序列合成,临用时用超纯水配制引物浓度为10μmol/L。
3.1710×PCR缓冲液
31825mmol/ L MgCl2。
3.19 dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。
3.20 Taq酶。
3.21 琼脂糖:电泳级。
3.22 溴化乙锭或 Goldview。
3.23 5×TBE缓冲液。
3.24 6×加样缓冲液。
3.25 DNA分子量标准。
4.检验程序
肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1。
5.操作步骤
5.1 样品制备
5.1.1 样品保存
待检样品应放置2℃～5℃冰箱冷藏。
5.1.2 固态与半固态食品
固体或游离液体很少的半固态食品,以无菌操作称取样品25g,放入无菌均质袋或无菌乳钵,块状食品以无菌操作切碎,含水量较髙的固态食品加入25mL明胶磷酸盐缓冲液,乳粉、牛肉干等含水量低的食品加入50mL明胶磷酸盐缓冲液，浸泡30min，用拍击式均质器拍打2min或用无菌研杵研磨制备样品匀液，收集备用。
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