1 范围
GB/T9695的本部分规定了肉与肉制品中α-生育酚含量的测定方法。
本部分适用于肉与肉制品中α-生育酚含量的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过GB/T9695的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分。
GB/T6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法(ISO3696:1987,MOD)
3 原理
试样经皂化后,用石油醚提取不皂化的维生素E,浓缩后,用高效液相色谱仪测定,用外标法计算试样中a生育酚的含量。
4 试剂
如无特别说明,所用试剂均为分析纯。
4.1 水:符合GB/T6682-2008规定的一级水
4.2 无水乙醇。
4.3 石油醚:沸程为30℃~60℃。
4.4 无水硫酸钠。
4.5 异丙醇。
4.6 甲醇:色谱纯或重蒸后使用。
4.7 氢氧化钾溶液(c=500g/L):称取50g氢氧化钾溶于水中,用水稀释至100mL
4.8 抗坏血酸溶液(c=100g/L):称取10g抗坏血酸(维生素C),溶于水中,用水稀释至100mL
4.9 α-生育酚标准物质:DL-α生育酚或DLα生育酚醋酸酯。
4.10 α-生育酚标准溶液
4.10.1 标准贮备液(c≈1000g/mL)
4.10.1.1 若标准物质(49)为a生育酚,则称取50.0mg,用异丙醇溶解,定容于50mL棕色容量瓶中。于4℃保存。临用前用紫外分光光度计按4.10.3标定其浓度
4.10.1.2 若标准物质(49)为a生育酚的酯类物质则称取50.0mg,按8.1~8.3进行皂化、提取、浓缩,用异丙醇溶解,定容于50mL棕色容量瓶中。于4℃保存
4.10.2 标准工作液
用异丙醇将已标定浓度的标准贮备液(4.10.1)稀释成所需的标准工作液临用前配制。
4.10.3 标准溶液的标定
移取α-生育酚标准贮备液(4.10.1)100μL于5mL具塞刻度试管中,用无水乙醇(4.2)稀释至3.0mL。于波长294nm处用紫外分光光度计(5.3)测定α-生育酚的吸光值按式(1)计算出a生育酚标准贮备液(4.10.1)的浓度:
式中:
α-生育酚标准贮备液的浓度,单位为克每毫升(g/mL);
A—α-生育酚的紫外吸光值;
E——α-生育酚的1%比吸光系数,即溶液浓度为1%光路为1cm时的吸收系数,值为71;
V1—移取α-生育酚标准贮备液的体积,单位为微升(pL)
5 仪器和设备
实验室常规仪器及下列仪器
5.1 机械设备:用于试样的均质化。包括高速旋转的切割机,或多孔板的孔径不超过4mm的绞肉机。
5.2 旋转蒸发仪。
5.3 紫外分光光度计。
5.4 液相色谱仪:带紫外光或荧光检测器
6 取样
实验室所收到的样品应具有代表性且在运输和储藏过程中无受损或发生变化。
取样方法参见GB/T9695.19。
取有代表性的样品200g。
7 试样制备
使用适当的机械设备(5.1)将试样均质。注意避免试样的温度超过25℃。若使用绞肉机,试样至少通过该设备两次。将试样装入密封的容器里,防止变质和成分变化。试样应在均质化后24h内尽快分析。
8 分析步骤
注:α-生育酚易被氧化,试验应避光或充氮操作,并使用棕色玻璃仪器。
8.1 皂化
称取0.5g~5g(准确至0.001g)试样于150mL烧瓶中,加入3mL抗坏血酸溶液(4.8)、5mL氢氧化钾溶液(4.7)、30mL无水乙醇(4.2),混匀,于沸水浴上回流15min~30min,至试样溶液澄清,皂化后用流水冷却。
8.2 提取
将皂化后的试样溶液移入125mL分液漏斗中,用30mL石油醚(4.3)分数次洗皂化瓶,洗液并入分液漏斗中,塞上塞子,轻摇分液漏斗,避免乳化。静置,分层后,将水层放入第二个分液漏斗中,醚层留在第一个分液漏斗中。于第二个分液漏斗中加入10mL石油醚(4.3),进行第二次提取,石油瞇层并入第一个分液漏斗中。重复提取3次~4次。石油醚层并入第一个分液漏斗中石油醚层反复用水洗涤,至水层呈中性(pH约为7)。弃去水层。将分液漏斗中的石油醚层经无水
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